Biblioteki

biblioteka genomowa

zbiór fragm chromosomalnego i oranelarnego DNA org umieszczonych w okr wektorach (wielkość zal od met i przygorowania DNA)

bibloteka cDNA

analogiczny zbiór fragm DNA powstałych na matrycy mRNA poprzez odwrotną trankrypcję (wielkość fragm zal od długości mRNA i metody)

Biblioteka cDNA liczebność

liczebność zależy od poziomu transkrypcji poszukiwanego genu – udział w puli cDNA

Biblioteka znormalizowana

zawiera wyrównanie liczebności cDNA poszczególnych genów

Reakcja chemiczna II-rzędu

r=k[A][A]=k[A]2 r- szybkość rcji [A]- stężenie substratów tu nić DNA

Normalizacja bibliotek cDNA

mniej więcej równa reprezenacja licznych i mniej licznych transkryptów

Wytrącanie cząsteczek kw nulk z roztworów

Biotynę można dodać do czapeczki lub startera, streptamidyną pokryte są kulki metalowe i można te cząsteczki wytrącić z roztworu bo one razem się prawie magnetycznie łączą

Wytrącanie cząsteczek kw nulk z roztworów i zależność szybkości od stężenia

Jeżeli mamy duże stężenie obydwu nici to reakcja renaturacji przebiega szybciej. Jak małe to o wiele wolniej

przeglądanie różnicowe (differential screening)

w stos dużym zbiorze klonów (bibl) wyszukiwanie pojedynczych klonów, które ulegaja ekspresji tylko w jednej ze sprawdzanych tk (organi, stanie fizjol)

Subtrakcja (subbtraction)

(tworzenie bib subtrachowanej) masowe i automatyczne

Standardowe przeglądanie biblioteki

• zwykła bibl cDNA (z mRNA +): poszukiwanie gł klonów indukowanych • wysiew bibl i odciski replik na filtrach • konstrukcja sond molek + i – cDNA i hybrydyzacja

Cold plaque screening -, przeglądanie zimnych łysinek” (virtual subtraction)

• bibl cDNAA z mRNA + nie trzeba replik odcisków • sonda z mRNA - • ciekawe są te łysinki które nie hybrydyzują

dotblot z cDNA z tkanki (zal od stężenia)

jak go jest dużo to pojawia się w postaci ciemnej plamki. Izoluje się taką sekwencję i mnoży PCR. Umożliwia też sklonowaie genów o niskim poziomie ekspresjii